Используя меченные флуоресцеином Fab-фрагменты антител к иммуногло-булинам, связанным с мембранами В-клеток, можно увидеть, что иммуногло-булины распределены по поверхности клетки довольно равномерно. Однако если вместо Fab-фрагментов взять бивалентные антитела, способные сшивать молекулы поверхностных иммуноглобулинов, то последние тут же преципити-руют в мембране с образованием флуоресцирующих пятен неправильной формы (пэтчей). Ингибировать образование пэтчей можно, лишь используя факторы, уменьшающие текучесть внешнего слоя плазматической мембраны — например, добавляя стеролы или понижая температуру.

За несколько минут образования пэтчей они соединяются с актином и мио-зином на внутренней стороне мембраны (рис. 12.2), затем объединяются друг с другом и мигрируют к одному из концов клетки (рис. 12.4). Флуоресценция концентрируется на одном полюсе клетки, напоминая при рассматривании в флуоресцентный микроскоп лунный серп. Поэтому ее называют колпачком (кэпом). Кэп может выдаваться наружу, образуя отросток с неровным краем. Хотя меченные флуоресцеином антитела против иммуноглобулинов способны в течение 10 мин вьщвать кэппинг, у 90% В-клеток исчезновение флуоресци¬рующей области происходит значительно дольше, занимая от нескольких минут до 1 ч. При этом многие В-клетки становятся поразительно подвижными, сколь¬зя в направлении, противоположном отростку [19].

В клетках некоторых типов при кэппинге часть пэтчей впячиваются вовнутрь, образуя сначала окаймленные ямки, а затем окаймленные пузырьки, которые увлекают внутрь материал с поверхности клетки. Этот процесс, назы¬ваемый эндоцитозом, зависит от системы микрофиламентов. В нормальных лим¬фоцитах окаймленные ямки не видны, однако под образующимся кэпом часто наблюдаются эндоцитозные вакуоли, где распадаются проникшие внутрь моле-кулы иммуноглобулинов. Второй механизм исчезновения кластеров поверхност-ных иммуноглобулинов с мембраны заключается в сбрасывании их в среду, но этот процесс более выражен в бластах, чем в малых лимфоцитах, и не зависит от присоединения лиганда. После кэппинга на клетке некоторое время нельзя обнаружить поверхностных иммуноглобулинов, однако с помощью флуорес¬центно-меченных антител было показано, что распределение других поверхност¬ных молекул не нарушается. Постепенно в течение следующих 24 ч зрелая В-клетка синтезирует новые молекулы поверхностных иммуноглобулинов, кото¬рые появляются на мембране. В отличие от зрелых лимфоцитов В-клетки ново¬рожденных особей после кэппинга слабо ресинтезируют поверхностные имму¬ноглобулины. За исключением образования пэтчей и сбрасывания рецепторов, все остальные описанные процессы могут протекать лишь при наличии актив-лого клеточного метаболизма.

Антигены также могут вызывать кэппинг поверхностных иммуноглобули¬нов в очень небольших субпопуляциях В-клеток, имеющих соответствующие
поверхностные рецепторы (антигенсвязывающие клетки). Кэппинг, вызываемый антигенами, можно обнаружить с помощью методов радиоавтографии (исполь¬зуя радиоактивно меченные белковые антигены), иммунофлуоресценции или же применив видимые антигенные частицы, например чужеродные эритроциты. Рецепторы на поверхности антигенсвязывающих Т-клеток также могут быть собраны в кэп при взаимодействии с антигеном [20].
Кэппинг не ограничивается лишь поверхностными иммуноглобулинами, или лимфоцитами, или тучными клетками. В клетках многих типов различные интегральные белки наружного слоя плазматической мембраны способны обра¬зовывать кэпы, сшиваясь друг с другом за счет соответствующих лигандов или антител. Молекулы клеточной поверхности сильно различаются по способно¬сти к кэппингу. Эта способность зависит от прочности их ассоциации с сосед¬ними мембранными молекулами, а также их расположения и ориентации в мем¬бране. Такие молекулы, как белки класса I главного комплекса гистосовмести-мости (МНС) или Thy-1, в присутствии антител не образуют кэпов, если при этом не добавлены антитела против первых антител для усиления сшивки. Но даже и в этом случае кэппинг идет медленно и не до конца. С помощью иммуно-флуоресцентной микроскопии показано, что при образовании кэпа под ним концентрируются сократительные белки актин и миозин. Действительно, имеют¬ся данные, согласно которым агрегация поверхностных иммуноглобулинов вы¬зывает их присоединение к цитоплазматическим сократительным микрофила-ментам, содержащим актин {возможно, посредстром какого-то связующего белка во внутреннем слое плазматической мембраны), и поэтому сокращение микро-фил аментов приводит к кэппингу (рис. 12.2). В то же время такие молекулы, как антигены класса I МНС или Thy-1, не ассоциируют с сократительными белками. Кэппинг в этих случаях объясняется простой диффузией и слиянием пэтчей друг с другом без активного участия микрофиламентов.

Можно ли считать кэппинг «активационным процессом»? Нет, нельзя, если в качестве критериев активации выбраны синтез ДНК и секреция иммуногло-булинов. Формирование колпачка под действием антител к иммуноглобулинам не влияет на способность клеток селезенки мыши образовывать гемолитические пятна в ответ на антиген. Димерный сукцинил-Кон А вызывает синтез ДНК, не индуцируя при этом кэппинга. Агглютинин из зародышей пшеницы стимули¬рует кэппинг и некоторые ранние процессы, однако синтеза ДНК по полной программе при этом не наблюдается. То же самое при некоторых условиях мож-но сказать и про антитела к иммуноглобулинам. Характерно, что оптимальные для кэппинга условия предполагают значительно большие концентрации та¬ких антител (т. е. более высокую степень сшивки поверхностных иммуноглобу¬линов), чем оптимальные условия для синтеза ДНК. Аналогичным образом концентрации антител к IgE, оптимальные для образования колпачка из Fce-рецепторов на поверхности тучных клеток, значительно выше, чем для высво¬бождения гистамина (в последнем случае на поверхности клетки появляется лишь небольшой кластер из молекул рецепторов). Подобные сравнения лимфо¬цитов с тучными клетками наводят на мысль, что, хотя и кэппинг, и активация стимулируются сигналами, возникающими в мембране вследствие сшивки моле-кул поверхностных иммуноглобулинов, для кэппинга требуется полная преци-питация этих молекул с образованием видимых в микроскоп пятен, в то время как для активации необходимо образование лишь небольших локальных агре¬гатов.

Какая польза клетке от кэппинга, если он, по-видимому, не приводит к ак-тивации? Об этом можно лишь гадать. Не исключено, что сигнал к кэппингу представляет собой своего рода «регулировочное устройство». С помощью кэппинга клетка может избавляться от избыточного лиганда и таким образом в течение некоторого времени доводить концентрацию последнего до оптималь-ного для иммунного ответа уровня. Кэппинг может также предотвращать разру-шение клетки при взаимодействии с антителами, которые в противном случае могли бы вызвать ее гибель вследствие опсонизации антителозависимой клеточ-ной цитотоксичности или лизиса.

Как может использовать кэппинг иммунолог? Во-первых, кэппинг дает возможность избирательно убрать с клеточной мембраны молекулы одного типа. Во-вторых, образовав с помощью антител, меченных флуорохромом одного типа, кэп из мембранных молекул А, добавив затем ингибитор кэппинга и антитела к молекуле Б, меченные флуорохромом другого типа, можно узнать, соединены ли друг с другом в мембране молекулы А и Б или нет. Антигенные детерминанты, участвующие в кэппинге независимо друг от друга, находятся, очевидно, в раз¬ных молекулах, а детерминанты, перемещающиеся при кэппинге совместно (кокэппинг), могут принадлежать одной и той же молекуле или же молекулам, взаимодействующим друг с другом. Например, как было показано, IgM и IgD на поверхности В-клеток образуют кэпы независимо друг от друга, а антигены к поверхностным иммуноглобулинам на антигенсвязывающих клетках — сов¬местно друг с другом. В-третьих, поскольку кэппинг идет всего несколько ми¬нут, он служит быстрым индикатором того, что в результате сшивки рецепто¬ров на поверхности мембраны возник сигнал, поступивший в клетку. Исполь¬зование такого сигнала становится особенно удобным, если учесть, что в срав¬нении с кэппингом вся программа активации клетки занимает несколько дней и представляет собой крайне сложную совокупность процессов, чтобы ее можно было анализировать шаг за шагом. Тучные клетки, высвобождающие гистамин через несколько минут после сшивки Гсе-рецепторов, представляют собой еще одну модель, которая обладает аналогичными преимуществами.

Анализ последовательности этапов, ведущей от сшивки рецепторов к кэп-пингу, облегчается наличием многих обратимых ингибиторов кэппинга с раз-личными механизмами действия. К таким ингибиторам относятся стеролы (уменьшающие текучесть мембраны), хлорпромазин (транквилизатор, способ¬ный, кроме того, вытеснять кальций с внутренней стороны плазматической мембраны), ионофор кальция (белок, интегрирующийся в мембрану и форми¬рующий канал, по которому кальций устремляется внутрь), цитохалазины В и D (затрудняющие ассоциацию сократительных белков в активные микрофила-менты), пропанолол ф-адренергический блокатор, затрудняющий также вы¬свобождение кальция из саркоплазматического ретикулума скелетной мышцы), дибукаин (используется в качестве местного обезболивающего средства и, кро¬ме того, ингибирует активное поглощение кальция саркоплазматическим рети-кулумом, необходимое для поздних процессов сокращения), ингибиторы ана¬эробного гликолиза, например фториды, и ингибиторы аэробного гликолиза, такие, как азид. Ингибиторы перечислены в той последовательности, в которой они действуют. Эта последовательность изучалась в опытах со следующей схе¬мой. В культуру В-клеток добавлялись меченные флуоресцеином антитела про¬тив иммуноглобулинов и один из обратимых ингибиторов. После инкубации первый ингибитор заменяли вторым ингибитором и проводили повторную инку¬бацию. Если действие первого ингибитора в цепи реакций, составляющих кэп¬пинг, предшествует действию второго ингибитора, то образования кэпов на¬блюдаться не будет. В противном случае кэпы будут образовываться. Получен¬ные данные показали, что существует линейная последовательность реакций, ведущая от сшивки рецепторов к образованию кэпа [21]. Несомненно, что сиг¬нал, инициирующий кэппинг, должен быть значительно проще, чем актива-ционный «сигнал». По схеме, аналогичной только что приведенной, была изуче¬на цепь реакций, ведущая от сшивки Fcg-рецепторов к высвобождению гиста-мина из тучных клеток.
Помимо приведенных веществ предотвращать кэппинг способны также соединения, ингибирующие трансметилирование, например S-изобутил-З-деазо-аденозин. В то же время известные ингибиторы липоксигеназной цепи реакций, синтеза белка и вещества, изменяющие концентрации циклических нуклеоти-дов, не способны заметно ингибировать кэппинг. Колхицин, связывающийся с субъединицами тубулина, что предотвращает их полимеризацию в микро¬трубочки, в некоторых условиях усиливает кэппинг, но он также может ока-
заться потенциальным ингибитором кэппинга, вызываемого неоптимальными концентрациями цитохализинов.
Для ознакомления с литературой, посвященной кэппингу, можно реко-мендовать подробные обзоры [19, 22].